【陈巍学基因】视频 132：深度解读 2024 年诺贝尔生理学奖——发现并确认 microRNA 的调控作用
大家好，欢迎来到【陈巍学基因】， 今天要和大家谈的 是“深度解读 2024 年诺贝尔生理学奖
——发现并确认 microRNA 的调控作用” 今天的讲解，会分成两个大部分 第一部分，会讲解 2024 年诺贝尔生理学奖的获奖内容的概要 第二部分，会对获奖项目中的三篇主要论文做技术层面的
深度讲解 讲解论文作者用什么样的实验方法、技术手段 得到了什么数据结果 又如何整合这些数据结果 来研究并判定 microRNA 对时间发育的调控作用 如果是对奖项大体内容已有了解 只想看深度讲解的同学 可以直接跳到视频的这个时间（3 : 30），直接往下看 接下来，我们从第一部分，开始讲解 2024 年诺贝尔生理学或医学奖 被授予科学家维克托·安布罗斯（Victor Ambros）
和加里·鲁夫昆（Gary Ruvkun） 表彰他们发现 microRNA 在转录后基因调控中作用的贡献 这是两位得奖者发表的关于 microRNA 及其调控功能的
三篇最重要的论文 前两篇是在 1993 年 发表在《Cell》杂志上的，是关于发现 microRNA 以全新的
方法调控基因表达的 第三篇是在 2000 年，发表在《Nature》杂志上 是关于在广泛的两侧对称的动物种类中 都有一个高度保守的 let-7 microRNA，参与时间发育调控 Ambros 和 Ruvkun 两人 从 1980 年代起就在研究秀丽隐杆线虫（ Caenorhabditis elegans，缩写为 C. elegans）的时间发育 在下文中为了方便叙述，我们将用“线虫”
来代指“秀丽隐杆线虫” 有两种突变的线虫，在发育过程中表现出时间发育的缺陷 研究发现，这两个突变的线虫株，突变的基因
分别是 lin-4 基因、和 lin-14 基因。 进一步的研究发现，lin-4 基因似乎是 lin-14 基因的负调节因子 两位科学家分别分析了 lin-4 突变体 他们都发现 lin-4 基因产生出很短的 RNA 分子 但是这个 RNA 分子不编码蛋白 这在当时是一个令人惊讶的结果 RNA 不编码蛋白质，那它怎么能抑制 lin-14 基因？ 两位科学家分别进一步研究了 lin-4 基因的调控功能 研究表明，lin-4 基因转录出来很短的 RNA 与 lin-14 mRNA 关键片段中的互补序列相互匹配 这很短的 RNA 也被称为 microRNA 实验表明 lin-4 microRNA 通过与 lin-14 mRNA 中的互补序列
结合，来关闭 lin-14（基因） 从而阻断了 lin-14 蛋白的产生 这在当时，是一种全新的基因调控原理： “microRNA 分子，通过结合到靶标 mRNA 上 来阻止靶标 mRNA 翻译成蛋白，达成调控效果” Ruvkun 进一步研究发现 let-7 microRNA 在所有的双侧对称动物中保守 并且这个 let-7 microRNA 参与调控动物的时间发育 由 Ambros 和 Ruvkun 首次揭示了 microRNA 基因调控机制 这种机制使越来越复杂的生物体能够按时间发育 然后有更多的科学家投入到了 microRNA 的研究中 科学家们从基因研究中了解到 microRNA 广泛参与细胞和组织的发育 microRNA 的异常调节会导致癌症 并且在人类中发现了多种编码 microRNA 的基因突变 会导致先天性听力损失、眼睛和骨骼等疾病 接下来，我们进入第二部分，对三篇主要的论文做深度解读 先讲第一节：发现 lin-4 编码的 microRNA
调控 lin-14 转录后的翻译 这一节的内容，出自三篇论文中的第一篇 这篇论文的题目 是《The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to lin-14》 文章的题目翻译成中文 意思是《秀丽隐杆线虫异时性基因 lin-4 编码
与 lin-14 反义互补的小 RNA》 在接下来讲解之前，提醒一下大家，这是 1993 年发表的论文 当时没有高通量测序技术，也没有定量PCR技术，
更没有线虫的全基因组参考序列 在当时论文作者要解决分子生物学问题，
就只能依靠当时有的技术来解决问题 因此，大家会在讲解中，看到许多当时用的分子生物学技术 在之前的研究中，已经知道 lin-4 基因突变对线虫的表型有影响 而lin-4这个基因突变，是被包在一个编号为“e912”
的突变的范围内 通过遗传作图，把 lin-4 基因定位
在 bli3 和 dpy-10 这两个基因之间 然后，用多个YAC（酵母人造染色体）、
粘粒（cosmid）和质粒 来克隆 bli3 和 dpy-10 这两个基因之间长长短短的各种基因片段 用这些基因片段进行相互的比对，经过排列组合，
看哪些基因片段可能含有 lin-4 基因的 哪些片段是不含 lin-4 基因的 这样持续缩小 lin-4 基因可能在的范围 经过一系列的比对之后 发现编号为 pVT2D 的这个质粒，包含了完整的 e912 突变
所对应的野生型序列 并且把 pVT2D 这个质粒对突变的线虫做拯救实验 结果它（pVT2质粒）能够拯救突变型的线虫 这里解释一下“拯救实验” 就是把一个质粒对突变的动物做转基因 看是否能够通过转基因把有突变表型的动物，
转变成野生的表型 通过这个来判断这个质粒中是否含了目标的正常基因 这个 pVT2D 质粒能够拯救 lin-4 突变型的线虫 这个结果就说明这个质粒，包含了正常的、
有功能的 lin-4 基因 然后，把这个 pVT2D 质粒中的片段，再进一步
用限制性内切酶切分成很多个小片段 再（把切出来的小片段）分别装进质粒里，
再分别去做拯救实验 结果发现这个 pVTSal3 这个质粒，有拯救效果 这个质粒中的插入片段只有 0.7KB 的大小 这就可以用第一代测序把这大约 700 个碱基的片段，
用测序测通了 这是对 pVTSal3 质粒中的片段进行测序的结果 质粒中间的插入片段一共是 693 个碱基 这个图中包含了对 4 种线虫相对应的片段的测序结果 我把这四种线虫的拉丁文学名，放大之后，打在了屏幕上 比较四种线虫基因序列的保守性，可以看到有 2 段保守的序列 第一段是从第 85 个碱基，到 350 个碱基 第二段是是第 500 个碱基，到第 600 个碱基 作者分析了在 4 种线虫中，这个 693 个碱基的片段中，
有没有合适的蛋白翻译框 这张图，从左到右，就是四种线虫对应的 DNA 片段 从上到下，分成了四个大格子，每个大格子对应一种线虫 每一个大格子，从上到下又分了6个小格子 每一个小格子，就是一个阅读框 因为三个碱基对应一个氨基酸，所有正向就有 3 个阅读框 再加反向序列还有 3 个阅读框，这样就有了 6 个阅读框 每个小格子，从左到右都有若干条小线段 不到顶的小线段，就是有 ATG 这三个碱基，
这就是可能可以做翻译起始位点的位置 每个到顶的线段，就是一个终止密码子 那么这些起始密码子、和终止密码子之间序列，
也许会成为蛋白的翻译框 作者在这些可能的翻译框中加入了几种干扰性的突变 看哪些突变会破坏质粒的拯救活性 也就是看这些可能的蛋白翻译框中，哪段序列
可能是编码有拯救活性的蛋白质的 在第 90 个碱基处，加入了一段 82 个碱基的片段 在加了这段 82 个碱基的序列之后，质粒还是有拯救活性 在第 259 个碱基处，加入一个碱基 被加了这一个碱基的质粒，还是有拯救活性 而这 2 处插入序列，打破了从第 1 个碱基，到第 429 个碱基
之间的一个阅读框 在第 53 个碱基处、和在第 111 个碱基处，分别替换成
终止密码子，质粒依然有拯救活性 把第 546 位处，一个天然的 ATG 序列，突变成 ACG 序列 也就是把翻译的启始密码子，换成非启始密码子，
结果质粒依然有拯救活性 上述的这几个实验，把这 600 多个碱基的序列，
插入各种打断蛋白翻译的突变 来看对拯救效果的影响 结果这些突变都没有影响这段序列的拯救效果 于是，作者推测这段序列可能不是通过翻译出一个蛋白质，
来达成对线虫的拯救效果的 既然 lin-4 的调控作用不是通过蛋白质来执行的 那么作者就推测起调控作用的可能是转录出来的 RNA 于是，作者设计了一系列的杂交探针 图中“rf”开头的箭头，就是 DNA 探针 “T7”开头的，是用 T7 启动子转录出来的 RNA 探针 并且这些探针都分别被标上了同位素，
将被用于后面的检测实验 接下来，作者对三种线虫的总 RNA 做 Northern blot 印迹检测 可以看到，被拯救的线虫样本中，有 2 个条带，
对应于 2 个小的转录本 长的这个转录本，被命名为 lin-4L，
“L”就是“长”（Long）的意思 经过分析，它的长度是 61 个碱基 短的这个转录本，被命名为 lin-4S，
“S”就是“短”（Short）的意思 经过分析，它的长度是 22 个碱基 作者用引物延伸法，来寻找 lin-4L 和 lin-4S 的转录起始位点 这里先解释一下“引物延伸法”的工作原理 针对要检测的目标 RNA，先合成一段互补序列的 DNA 引物 并在引物上用放射性同位素做标记 用这个有同位素标记的引物，与含有目标 RNA 的样本
进行杂交，再进行逆转录延伸反应 引物就会以目标 RNA 为模板进行逆转录合成，
直到 RNA 的 5’末端 然后，将逆转录的产物进行电泳，再放射自显影 经过逆转录而延长了的 cDNA 链，
在电泳中会比原来的引物跑得慢 经过与一起电泳的 marker 标准品做对比 就可以得知 cDNA 相比于原来的引物，延长了多少个碱基 进一步就可以推算出 RNA 的转录起始位置 作者用引物延伸法，来寻找 microRNA 的转录起始位点 用的引物，就是图中 rfMGH3 这个引物，
并且这个引物被标上了同位素 左图，就是引物延伸后，电泳、再放射自显影的结果 图中左侧是 marker 标准品，右侧是 4 组样本 结果在“野生型”和“被拯救的样本”中，可以看到条带 这个条带，长度是 49 个碱基 对应到序列图中，可以得到两种 lin-4 的 microRNA
的转录起始位点 也就是图中垂直的这个箭头所指的位置，
也就是第 513 位的这个 C 碱基 接着作者用 S1 核酸酶保护法，来进一步
确定 microRNA 的起止位点 这里介绍一下“S1 核酸酶保护实验”的工作原理 S1 核酸酶的特点是，它只消化单链 DNA 或单链 RNA，
但不消化双链核酸 S1 核酸酶保护法的原理，是利用 S1 核酸酶的这个特性 先用已知序列、已知长度的 DNA 单链或 RNA 单链 在其一端加上同位素标记，得到放射性探针 然后，把这放射性探针与样本核酸进行互补杂交 再用 S1 酶进行消化，这样就只留下能够互补杂交的序列 不能互补杂交的序列都会被消化掉 双链的核酸受到“保护”，这个“保护”有两层意思 一是如果样本中有与探针互补的序列，那探针会被保护 并且能够被保护的探针的量，与样本中
有多少与探针互补的 RNA 量直接相关 二是，探针的整个序列中，如果只有部分序列
与样本中的 RNA 序列互补 那就只有这部分互补的序列会被保留，
不互补的序列就会被消化掉 那剩下的探针长度，就是互补部分序列的长度 消化完成之后，跑电泳，再放射自显影 电泳条带的位置，对照标准品的 marker 条带，
就可以知道探针被保留下来的长度 条带的显影颜色深度，则显示了样本中
能够与探针互补的 RNA 的量 这是作者再用 S1 核酸酶保护法，来确定 microRNA 的起止位置 B 图，是用 rfMGH1 探针 与拯救样本的 RNA，做 S1 核酸保护实验之后，得到的条带 比对到基因序列上，就显示出了 lin-4L 的 5’端的位置 C 图，是用 rfMGH5 这个探针 与拯救样本的 RNA，做 S1 保护实验 得到的条带，比对到基因序列上，
就显示出了 lin-4L 的 3’的位置 是第 573 位的这个 C 碱基 这样就完全确定了 lin-4L 这个 microRNA 的起始和终止位置 把 lin-4L microRNA 的序列对应到基因序列图上，
就是图中这个长箭头的位置 这是用 S1 核酸酶保护法，来确定 lin-4S 的起止位点 A 图中，是用 T7 （Eco）RI，和 T7 DdeI 这 2 个探针，
分别做 S1 核酸酶保护法，得到的结果 可以看到，DdeI 这个探针得到的片段，比（Eco）RI
这个探针得到的片段短了 5 个碱基 这说明 lin-4S 的起始位点在 DdeI 的再上游 5 个碱基 也就是和 lin-4L 是相同的起始位点 B 图，是用 rfMGH8 这个探针，做 S1 核酸酶保护法实验 可以看到，不同的反应温度，消化得到的片段长度不一样 估算出来的 lin-4S 的长度，是 20 ± 2 个碱基 把 lin-4S microRNA 的序列对应到基因序列图上，
就是图中的这个短箭头的位置 作者用非互补筛选法（Noncomplementation screen）扫描了 2 万个染色体 确认了一个新的 lin-4 突变等位基因“ma161” 这里解释一下这个“非互补筛选法” lin-4 基因突变，本身是一个隐性突变 所以，只有一个 lin-4 基因拷贝有突变的线虫，
并不会表现出明显的发育变异 只有两个 lin-4 基因拷贝都发生了失活突变，
线虫才表现出变异的表型 对野生型的线虫，用诱变剂进行培养 再把经过了诱变的线虫，与含 lin-4 隐性突变的
（线虫）株进行杂交 杂交出来的大量线虫中，会有少量的线虫，
出现 lin-4 突变的表型 再针对这些有 lin-4 突变表型的线虫，
检测 lin-4 基因附近的基因序列 看看里面发生了什么突变 这些突变，很可能就是导致 lin-4 基因发生功能丧失的突变 前面说到，作者用非互补筛选法（Noncomplementation screen）扫描了 2 万个染色体 确认了一个新的 lin-4 突变等位基因“ma161” 再用 PCR 方法扩增 ma161 这个等位基因，并进行测序 发现它在第 517 位，把原来的 C 碱基，突变成了 T 碱基 这个突变，正好会在 lin-4L 和 lin-4S 这两种 mircoRNA 中
都引起序列突变 lin-4 基因转录出来的 microRNA 的序列，会与 lin-14 基因
转录出来的 mRNA 上 3’ UTR 区域中的 7 个串联的序列互补 互补的情况如 B 图所示 能引起 lin-4 基因失活的 ma161 突变，也正好在互补的序列中 作者推测，就是 lin-4 转录出的 microRNA 通过与 lin-14 转录出的 mRNA 的 3’ UTR 区域相结合 来抑制 lin-14 mRNA 翻译成蛋白，
进而抑制 lin-14 基因的功能活性 接下来，对这第一篇论文做一下小结 1、用实验判断了，lin-4 基因不太可能通过翻译出蛋白
来调控 lin-14 基因的表达 2、用实验确定了 lin-4 转录出来的 microRNA 的准确大小 3、转录出来的 microRNA 序列与 lin-14 的 mRNA 的 3’ UTR 序列有 7 处互补 4、推测 lin-4 基因可能是通过转录出来的 microRNA 与 lin-14 mRNA 的 3’ UTR 序列互补结合，
来调控 lin-14 基因的表达 接下来，我们讲第二部分的第二节 确认 lin-4 转录的 micro RNA 对 lin-14 的转录后调控 第二篇论文的题目 是《Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene lin-14 by lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. elegans》 翻译成中文，意思是《 lin-4 对异时性基因 lin-14 的
转录后调控，介导秀丽隐杆线虫的时间模式形成》 Ruvkun 用电泳加印迹显示的方法 来比较几个线虫株中， lin-14 基因转录出来的 mRNA 的量，
和翻译出来的蛋白的量的变化 上面的 A图，是对 lin-14 蛋白的电泳，做免疫印迹的结果 下面的B图，是对 lin-14 的 mRNA 做核酸印迹杂交的结果 图中，WT 是野生型的线虫 lin-4 e912 是 lin-4 发生突变的线虫 lin-14(n355gf) 是 lin-14 基因发生获得功能突变的一个突变株 “gf”就是获得功能，gain function 的首字母缩写 lin-14(n536gf) 是另一个 lin-14 基因发生获得功能突变
的一个突变株 一共是三个突变型的线虫株 标识“E”，是 Early，早期的意思；“L”是 late，后期的意思 lin-14，就是 lin-14 的蛋白、或 mRNA，在被印迹显色之后，得到的条带 Myo-1，是肌球蛋白基因的 mRNA 肌球蛋白基因，是一个看家基因，它在各种细胞中
都会有稳定的表达 放在这里，是作为总 RNA 上样量的一个内参 Myosin，是肌球蛋白，就是 myo-1 基因表达出来的蛋白 就是看家蛋白 放在这里，也是作为蛋白电泳上样量的内参 在蛋白的印迹图中，67KD 和 70KD 两个条带都是 lin-14 蛋白 我们先看野生型 野生型在早期和后期，lin-14 的 mRNA 的量没有大的变化 但是 lin-14 的蛋白在早期是高表达的 到后期，表达的 lin-14 蛋白量只有早期的 1/10，
在电泳印迹图中几乎看不到条带 这说明，有一种调控，在转录以后的环节中 对 lin-14 蛋白的量产生了调控 在三个突变株中 lin-14 mRNA 的量，在早期和后期没有大的差别 但是我们看蛋白 在 lin-4(e912) 这个株中，后期 lin-14 蛋白的量，
是前期的 1/2.3 在 lin-14(n355gf) 这个株中，后期蛋白量是前期的 1/1.3 在 lin-14(n536gf) 这个株，后期蛋白量是前期的 1/2.3 这说明，lin-4 发生突变，或者 lin-14 的 3′ UTR 区
发生获得功能的突变 都会让 lin-14 蛋白在后期的表达量，
相对于野生型的表达量变多 作者设计了一个“用 lacZ 基因作为报告基因，
来检测 lin-14 的 3’UTR 区受调控的质粒” 质粒中，中间的报告基因是 lacZ 基因 lacZ 基因就是“beta-半乳糖苷酶基因” 在 lacZ 基因的上游加一个 col-10 启动子 col-10 启动子，就是自然条件下 lin-14 基因的启动子 在 lacZ 基因的下游加一个 lin-14 3’UTR 序列 这样在 lacZ 基因的上下游，放上 lin-14 基因在自然条件下
的上下游（序列） 看 lacZ 基因的表达，就可以推估 lin-14 基因可能受到的调控 作者另外做了一个对照质粒 用 unc-54 的 3’UTR，来代替 lin-14 3’UTR 序列的质粒 unc-54 是编码肌球蛋白重链的基因 用这个看家基因的 3’UTR 序列，来作为一个对照组 再解释一下 lacZ 基因和 X-gal 化合物组成的
蛋白表达量报告系统 X-gal 就是左下图中的这个化合物 可以看到它的左半侧是一个半乳糖 lacZ 基因表达出来的半乳糖苷酶，可以把乳糖中的
半乳糖苷键切断 也可以把半乳糖连其它化合物的糖苷键切断 X-gal 也可以被 beta-半乳糖苷酶切断 产生出一个半乳糖，和一个吲哚基的化合物 这个吲哚基的化合物会自发地二聚化并氧化成
最右边的这个二聚体 这个二聚体有深蓝色，并且不溶于水 因为最终产物能够显示出蓝色 所以 lacZ 基因能够产生半乳糖苷酶，再切割 X-gal 化合物，
并显示出蓝色 就成为分子生物学中很常用的一个报告系统 用来检测 lacZ 这个报告基因的活性、和它所表达出来的
半乳糖苷酶的产量 把前面说的带 lacZ 报告基因的质粒转基因到线虫中 并且把线虫放在有 X-gal 的培养基中进行培养 看线虫体内是否出现蓝色，就可以知道线虫体内的 lacZ 基因
受到的表达调控的情况 这是用 lac Z 作为报告基因，看 lin-14 的 3’ UTR
对蛋白产量的影响 图中，左侧的图都是 L1 期，就是早期 右侧的图是L4，是后期 第一行，是用 unc-54 的 3’UTR 区作为对照组 可以看到在 L1 期和 L4 期，都有明显的 X- Gal 产生的
蓝颜色的染色 第二行，用野生型的 lin-14 的 3’UTR 区 可以看到，在 L1 期，虫体有 X-gal 染色，
而在 L4 期，虫体没有 X-gal 染色 第三行，用突变的 lin-14(e912) 的 3’UTR 区 可以看到在 L1 期和 L4 期，虫体都有 X-gal 染色 这说明了，在 in vivo 的体内条件下 野生的 lin-14 3’UTR 区，可以在 L4 期，
让 lacZ 基因几乎不产生蛋白 而突变的 lin-14(e912) 的 3’UTR 区，
则不能阻止 lacZ 蛋白的产生 这是对 3 个线虫的 RNA 样本做 S1 核酸酶保护实验得到的结果 用的杂交探针有两种，探针 A 是针对“lin-14”的
mRNA 的 3’ 端 UTR 序列的 同时这个探针也会覆盖到 pC10L14 质粒所产生
的 mRNA 的 3’UTR 区域的一部分序列 这个 pC10L14 质粒就是在 lacZ 基因的上下游
再加了 lin-14 基因的上下游的序列，得到的质粒 它的作用是用 lacZ 基因，来模拟 lin-14 基因在体内受到的调控 这个质粒在后面会被称为“lacZ 质粒” 因为这个质粒表达的 mRNA 下游，
会有 lin-14 基因的 3’UTR 序列 所以会部分被这个探针 A 保护到 探针 B 是针对 myo-1 基因的 也就是检测看家基因 mRNA 表达量的，起内参作用的 被检测的样品有三种 最左侧的这条泳道，是混合各个发育阶段的
野生型的线虫的总RNA 右侧两条泳道，是野生线虫被 lacZ 质粒转基因后的结果 其中，L1 是早期，L4 是后期 再看几条显色条带 89nt 是线虫内源性的 lin-14 mRNA 的受保护留下的条带 可以看到，L1 期和 L4 期的（lin-14 的） mRNA 量差不多 77nt，是转染进线虫的 lacZ 质粒，所表达出来的 mRNA，
受保护留下的条带 L1 期和 L4 期的（lin-14 的） mRNA 量也差不多 40nt，是 myo-1 基因 mRNA 的受保护留下的条带 L1 期和 L4 期的条带颜色深度差不多，说明
这两个样本的总 RNA 上样量差不多 可以看到，L1 期和 L4 期，内源表达的 lin-14 的 mRNA 的量，是差不多的 那么就要问，为什么 L1 期和 L4 期相比，
表达出来的 lin-14 的蛋白量，会差那么多？ 同样，L1 期和 L4 期，转基因质粒所表达的 lacZ 基因
的 mRNA 量也差不多 为什么 L1 和 L4 期表达出来的 lacZ 的蛋白量，会差那么多？ 中间是什么因素在起作用？ 这是检测 lin-14 基因在 C.briggsae 中的表达调控 C.Briggsae，翻成中文是“秀丽短体线虫” 它和 C.elegans 秀丽隐杆线虫的关系密切 最上面两张图，是对 C.briggsae 中的 Lin-14(P) 蛋白
进行免疫荧光染色，得到的结果 左侧是 L1 期的图，可以看到大多数细胞中有 lin-14(P) 蛋白 右侧是 L2 期的图，几乎看不到对 lin-14 蛋白的染色 中间的图，是用带 lin-14 的 3’UTR 区的报告质粒
进行转基因后 再进行的染色，得到的结果 左图是 L1 期的，可以看到有 X-gal 染的蓝色 右侧是 L4 期的，没有 X-gal 染色 最下面的两张图，是用带 unc-54 的 3’UTR 区的报告质粒，
来作为参照组 进行转基因后，再进行的染色，得到的结果 左侧是 L1 期，右侧是 L4 期，都看到有蓝色的染色。 这个实验说明 C.Briggsae 这个近亲线虫，在 lin-14 蛋白的表达调控上，
与 C.elegans 线虫有高度的相似性 两个物种中，在 lin-14 基因 3’UTR 区域的保守的序列
被测序测出来 上面的图，展示的是 C.elegans，和 C.briggsae，
在 lin-14 基因的 3’UTR 区域的保守情况 灰色的部分，是两者之间共同的保守的区域 7 个数字标了的黑色的区域，是既保守，
又与 lin-4 RNA 互补的区域 n536 突变缺失的片段被标示出来 它缺失了 7 个结合位点中的 5 个位点 之前对（lin-14）蛋白的检测中，n536 突变会让后期（lin-14）的蛋白量比野生型的多 4 倍左右 n355 突变的位置，也被标示出来 它是一个倒位突变，导致 lin-14 3’UTR 在 254 位碱基位置
发生断裂 并让 lin-14 （基因）完全失去 7 个 与 lin-4 microRNA 结合
的位点 之前对蛋白的检测中，n355 突变会让后期蛋白量
比野生型的多 7 倍左右 下面的图中，标示了 lin-14 3′ UTR 区域中 7 个与
lin-4 microRNA 互补区域的序列 接下来，对第二篇论文做一个小结 1、用实验证明了：lin-4 microRNA 能改变 lin-14(P) 蛋白的量 但并不改变 lin-14 的 mRNA 的表达量 所以调控起作用步骤是在 lin-14 基因的转录之后 2、通过用报告基因的蛋白产量，来检测 lin-14 的 3’ UTR 序列对其基因的蛋白产量的调控作用 确认 lin-14 的 3’ UTR 序列参与了其上游蛋白的表达调控功能 3、在 lin-14 基因的 3’ UTR 序列中，
有 7 处是与 lin-4 microRNA 序列互补的 并且，lin-14 基因的几个获得功能性突变，
也就是逃避 lin-4 microRNA 抑制的突变 就位于 lin-14 的 3’ UTR 序列中 接下来，我们讲解第三节：let-7 microRNA 在多种动物中
调控时间发育 第三篇论文的题目是 《Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA》 论文题目翻译成中文，意思是《let-7 异时调节 RNA 的序列和
时间表达的保守性》 作者发现线虫从幼虫后期到成熟期，
需要 let-7 基因转录出的 microRNA 这个 microRNA 的成熟体的长度是 21 个碱基 在多种动物中，作者都检测到了 let-7 microRNA。
于是进行更深一步的研究 这张图展示了在线虫、果蝇、人类，三个物种中
编码 let-7 microRNA 的基因 转录出来的 microRNA 前体，会形成的茎环结构 图中的灰色阴影部分，就是成熟的 let-7 microRNA
的那部分序列 注意：在这三个物种中，成熟的 let-7 microRNA
的 21 个碱基序列，是完全相同的。 在人类基因组上，分别在第 9、第 11、和第 22 号染色体上，
有 3 处完全匹配这 21 个碱基的序列 另外，在人的第 9、第 21 号染色体，还有 2 处匹配 21 个
碱基中的 20 个碱基的序列 这张图，是：线虫、班马鱼、果蝇，这 3 个物种的 let-7 microRNA 与目标基因 lin-41 的 3’UTR 序列结合的位置 这张图，是对人体中各种器官的中的 let-7 microRNA 的含量，用 northern blot 的方法进行分析，得到的结果 可以看到，在人的各种器官中，let-7 microRNA 的含量
是不一样的 特别值得注意的是，在骨髓中，let-7 microRNA 的含量特别低 这与骨髓主要由未成熟的细胞组成，是一致的 let-7 RNA 在线虫的后期，调降 lin-41 基因 可能是因为 lin-41 含有与 let-7 互补的 3’UTR序列 lin-41 基因编码一个 RBCC 蛋白 这张图，是果蝇的发育过程，从早期到后期，
let-7 microRNA 的含量的水平 可以看到，直到三龄晚期幼虫时，let-7 microRNA 才刚刚出现 这刚好是在果蝇从幼虫转变成蛹之前 而在蛹的早期，let-7 的表达量增加了至少 10 倍 而且这种高表达持续到成虫期 作者发现，let-7 microRNA 在更多的动物中保守。 在多毛环节动物中，let-7 RNA 在后期、成熟期表达，
但在幼虫期不表达 在软体动物中，也是在成熟期表达，但在幼虫期不表达 这张图中，是用了环节动物门中的华美盘管虫 和软体动物门中的黄肋拟日月贝，来作为代表 都是幼虫期不表达，在成熟期有表达 let-7 microRNA 在脊椎动物中，也有表达 这张图，是在斑马鱼中，let-7 的时间发育表达情况 可以清楚地看到，48 小时之后，斑马鱼才有了
明显了 let-7 表达，之前则没有 这是用针对线虫的探针做的 S1 消化保护实验 结果证明，人类、果蝇、有与线虫
一样序列的 let-7 microRNA 这张图，是拿紫海胆各个发育阶段的 RNA，
做针对 let-7 microRNA 的 northern blot 的结果 同时旁边还加了一个线虫的 RNA 作为对照 可以看到 100 个碱基长度的 let-7 RNA 前体，在紫海胆的各个发育时间点，都大量存在 但只有在成熟期，才有 21 个碱基的短的 let-7 microRNA 这张 northern blot 图，展示了对多孔鹿角珊瑚、和星状珊瑚这两种刺胞动物 这张 northern blot 图，展示了对多孔鹿角珊瑚、和星状珊瑚这两种刺胞动物 还有细指海葵这种海绵动物的检测结果 都没有检测到 let-7 RNA 的表达 最右边是用线虫作为对照，线虫有明确的 let-7 表达 这张图，就是 let-7 RNA 表达的系统发育比较图 图中，有绿色“+”号的，就是这个物种是有 let-7 RNA 表达的 反之，用红色“-”号标示的，就是这个物种
是不表达 let-7 RNA 的 let-7 RNA 在双侧动物系统发育中是保守的 与此一致的是，let-7 的目标基因 lin-41 在
果蝇和脊椎动物中是保守的 let-7 RNA 的 21 个碱基的⻓度高度保守，
表明这个长度对它的功能至关重要 由于所有三个主要的双侧动物⻔都表达时间调控的 let-7 RNA 但是水螅纲、多孔动物和所有非动物物种
都没有表达可检测水平的 let7 RNA 所以，作者提出 let-7 这个基因在双胚层动物和双侧动物
分化之后，进化而来的 我们对第三篇论文，做一下小结 1、let-7 基因表达 microRNA，这在双侧对称动物中普遍存在 并且序列高度保守 但是 let-7 基因在部分低等动物中不存在，
在不是动物的生物中也不存在 2、let-7 microRNA 在动物中参与时间发育的调控 以上，是本次讲座的全部内容。 欢迎：点赞、收藏、转发
深度解读 2024 年诺贝尔生理学奖，发现并确认 microRNA 的调控作用。
讲解论文作者用什么样的实验方法、技术手段，得到了什么数据结果，又如何整合这些数据结果，来研究并判定 microRNA 对时间发育的调控作用。
参考文献：
1、Rosalind C. Lee, Rhonda L. Feinbaum, et al. The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to lin-14. [J] Cell, Vol. 75, 843-854, December 3, 1993
2、Bruce Wightman, Ilho Ha, et al. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene lin-14 by lin-14 Mediates Temporal Pattern Formation in C. elegans [J] Cell, Vol. 75, 855-862, December 3, 1993
3、Amy E. Pasquinelli, Brenda J. Reinhart, et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA [J] Nature, Vol 408, 2 November 2000
0:00 开场
0:41 概述
3:29 发现 lin-4 的转录后调控作用
16:55 验证 lin-4 的转录后调控作用
28:19 let-7 在多种动物中调控发育